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常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（*轉(zhuǎn)染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般來(lái)說(shuō)，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來(lái)幫助檢測(cè)。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過(guò)一些選擇性標(biāo)記，如來(lái)氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。
轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例，細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間等。一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，如DEAE右旋糖苷法，磷酸鈣法，電穿孔法，脂質(zhì)體法各有利弊，其主要原理及應(yīng)用特點(diǎn)見(jiàn)下表：
轉(zhuǎn)染方法 | 原理 | 應(yīng)用 | 特點(diǎn) |
磷酸鈣法 | 磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 | 不適用于原代細(xì)胞 操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差 有些細(xì)胞不適用 |
DEAE-右旋糖苷法 | 帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 | 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 | 相對(duì)簡(jiǎn)便、結(jié)果可重復(fù) 但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用 轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清 |
電穿孔法 | 高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過(guò)膜上形成的小孔導(dǎo)入 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 | 適用性廣但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大， 需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件 |
病毒介導(dǎo)法 | 通過(guò)侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 | 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等 |
逆轉(zhuǎn)錄病毒 | 特定宿主細(xì)胞 | 但攜帶基因不能太大細(xì)胞需處分裂期 需考慮安全因素 | |
腺病毒 | 通過(guò)侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中 | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 | 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 需考慮安全因素 |
陽(yáng)離子脂質(zhì)體法 | 帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 | 適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清。轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大 |
Biolistic顆粒傳遞法 | 將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放，表達(dá) | 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 | 可用于：人的表皮細(xì)胞，纖維原細(xì)胞，淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞 |
顯微注射法 | 用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 | 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限 多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞 |
;除上述傳統(tǒng)方法外，近年來(lái)上推出了一些陽(yáng)離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，以其適用宿主范圍廣，操作簡(jiǎn)便，對(duì)細(xì)胞毒性小，轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞。其中樹(shù)枝狀聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）的轉(zhuǎn)染性能*，但樹(shù)枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進(jìn)一步改性，且其合成工藝復(fù)雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽(yáng)離子電荷密度的有機(jī)大分子，每相隔二個(gè)碳個(gè)原子，即每“第三個(gè)原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿"(proton sponge)體。這種聚陽(yáng)離子能將各種報(bào)告基因轉(zhuǎn)入各種種屬細(xì)胞，其效果好于脂質(zhì)聚酰胺，經(jīng)進(jìn)一步的改性后，其轉(zhuǎn)染性能好于樹(shù)枝狀聚合物，而且它的細(xì)胞毒性低。大量實(shí)驗(yàn)證明，PEI是非常有希望的基因治療載體。目前在設(shè)計(jì)更復(fù)雜的基因載體時(shí)，PEI經(jīng)常做為核心組成成分。
線型PEI（Line PEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，過(guò)去的研究認(rèn)為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性較低，有利于細(xì)胞定位，因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些。但zui近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，從而提高轉(zhuǎn)染效率，但同時(shí)細(xì)胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低，但轉(zhuǎn)染效率卻較高。
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PEI轉(zhuǎn)染操作流程：
1、細(xì)胞傳代：
轉(zhuǎn)染前24h內(nèi)分離293T細(xì)胞至含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，接種密度如下：
6孔板：0.5x106細(xì)胞
10cm培養(yǎng)皿：4.0x106細(xì)胞
15cm培養(yǎng)皿：9.0x106細(xì)胞
2 、轉(zhuǎn)染
轉(zhuǎn)染前將所有試劑置于室溫。
2.1 質(zhì)粒DNA的稀釋
在無(wú)菌試管中，用無(wú)血清的DMEM W / O酚紅培養(yǎng)基（濃度為10％）稀釋質(zhì)粒DNA（ug）。病毒包裝體（psPAX2）：病毒包膜（pMD2G）和重組質(zhì)粒DNA的稀釋比例分別為4:2:1。
6 孔板：200ul+3ug的DNA
10cm培養(yǎng)皿：1ml+7-8ug的DNA
15cm培養(yǎng)皿：2ml+11-12ug的DNA
2.2 轉(zhuǎn)染復(fù)合體形成
將PEI（1ug/uL）加入已稀釋的總DNA中，PEI與DNA（ug）的混合比率為3:1。加入后立即渦旋混合。
6 孔板：9ul PEI復(fù)合體（1ug/ul）=9ug
10cm培養(yǎng)皿：21ul PEI復(fù)合體（1ug/ul）=21ug
15cm培養(yǎng)皿：33ul PEI復(fù)合體（1ug/ul）=33ug
將添加到細(xì)胞的DNA/ PEI的混合物在室溫下孵育15分鐘。
4 、收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞
轉(zhuǎn)染后48小時(shí)內(nèi)收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞/或病毒上清。
試劑的配制：
PEI（1ug/ul） Polysciences（CAT＃23966-2配制成儲(chǔ)液：
1、將無(wú)內(nèi)毒素的無(wú)菌水加熱至80℃左右溶解PEI，冷卻到室溫。
2、調(diào)整pH值至7.0，用0.22um的濾器過(guò)濾消毒，分裝后儲(chǔ)存在-20℃。工作液可保持在4℃。
96孔細(xì)胞培養(yǎng)板用量
細(xì)胞型號(hào) | 培養(yǎng)基 | 每孔細(xì)胞數(shù) | DNA的量 | 轉(zhuǎn)染試劑量 | 和培養(yǎng)基混合 4-6h |
| 293H | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL | DMEM+10%FBS |
| 293FT | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL | DMEM+10%FBS |
| 293E | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL | DMEM+10%FBS |
| 293F | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL | DMEM+10%FBS |
| COS7 | DMEM | 1.5×104 | 0.4µg | 0.5µL | DMEM+10%FBS |
| hela | DMEM | 2×104 | 0.3µg | 0.5µL | 1640+15%FBS |
| Caco2 | MEM | 3.5×104 | 0.3µg | 0.75µL | MEM+10%FBS |
| BHK21 | MEM | 2×104 | 0.2µg | 0.5µL | MEM+10%FBS |
| CHO-DG44 | DMEM+HT+pro | 2×104 | 0.5µg | 0.5µL | DMEM+HT+pro +10%FBS |
| RAW264.7 | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL | DMEM +10%FBS |
| MCF7 | MEM/NEAA+0.01mg/mL insulin + sodium pyruvat | 2×104 | 0.1µg | 0.25µL | MEM/NEAA+0.01mg/mL insulin + sodium pyruvat+10%FBS |
| SW480 | IMDM | 3×104 | 0.4µg | 0.5µL | IMDM +10%FBS |
| MDCK | DMEM | 4×104 | 0.6µg | 1µL | DMEM+10%FBS |
| CHO-K1 | IMDM+Pro | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL | IMDM+Pro +10%FBS |
| HepG2 | DMEM | 3×104 | 0.5µg | 0.75µL | DMEM+10%FBS |
| A549 | DMEM | 2×104 | 0.3µg | 0.5µL | DMEM+10%FBS |
| NIH/3T3 | DMEM | 1.5×104 | 0.1µg | 0.75µL | DMEM+10%FBS |
| vero | DMEM | 3×104 | 0.3µg | 0.75µL | DMEM+10%FBS |
| sf9 | SIM SF | 5×104 | 0.4µg | 0.75µL | SIM SF+10%FBS |
PEI于polyplus轉(zhuǎn)染效率對(duì)比圖
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Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) 23966-2為Polysciences公司生產(chǎn)的化合物產(chǎn)品，每批產(chǎn)品出廠前都經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的檢測(cè),保證每批產(chǎn)品都*、穩(wěn)定且高品質(zhì),但由于作為轉(zhuǎn)染試劑使用過(guò)程中有很多實(shí)驗(yàn)室因素(PH,水純度,稱量的準(zhǔn)度,dna純度…)造成溶解出現(xiàn)問(wèn)題或者轉(zhuǎn)染效率出現(xiàn)差異,所以廠家只受理該產(chǎn)品純度，分子量及重量缺失破損等相關(guān)投訴，針對(duì)極個(gè)別客戶溶解問(wèn)題和轉(zhuǎn)染效率問(wèn)題我們只能友善解決,所以不能保證您能獲得滿意答復(fù)，對(duì)于產(chǎn)品應(yīng)用方法的問(wèn)題，不作為評(píng)價(jià)我們售后工作的依據(jù)。
如果我們提供的PEI手冊(cè)都無(wú)法解答您的問(wèn)題,建議您可以多看文獻(xiàn),多調(diào)整一下轉(zhuǎn)染條件,找出適合自己細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法。如果無(wú)暇摸索條件,您也可以直接購(gòu)買我們配好的轉(zhuǎn)染試劑,這樣免去您很多煩惱,謝謝理解
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